Pole biotechnológie je jednou zo stálych zmien. Rýchly rast a rozvoj špičkového výskumu závisia od inovácie a tvorivosti vedci a ich schopnosť vidieť potenciál v základnej molekulárnej technike a aplikovať ho na nové procesy. Nástup polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) otvorilo mnoho dverí v genetickom výskume vrátane prostriedkov DNA analýza a identifikáciu rôznych génov na základe ich DNA sekvencií. Sekvenovanie DNA závisí aj od našej schopnosti používať gélová elektroforéza aby sa oddelili vlákna DNA, ktoré sa líšia veľkosťou už od jedného páru báz.
Sekvenovanie DNA
Na konci sedemdesiatych rokov boli vynájdené dve techniky sekvenovania DNA pre dlhšie molekuly DNA: metóda Sanger (alebo dideoxy) a metóda Maxam-Gilbert (chemické štiepenie). Metóda Maxam-Gilbert je založená na nukleotidovo špecifickom štiepení chemikáliami a najlepšie sa používa na sekvenovanie oligonukleotidov (krátke nukleotidové polyméry, zvyčajne kratšie ako 50 párov báz). Metóda Sanger sa používa častejšie, pretože sa ukázalo, že je technicky jednoduchšie ju uplatňovať, a to spolu s príchod PCR a automatizácia techniky sa ľahko aplikuje na dlhé vlákna DNA vrátane niektorých celých gény. Táto technika je založená na ukončení reťazca dideoxynukleotidmi počas PCR elongačných reakcií.
Sangerova metóda
V Sangerovej metóde sa vlákno DNA, ktoré sa má analyzovať, používa ako templát a DNA polymeráza sa v reakcii PCR používa na generovanie komplementárnych vlákien pomocou primérov. Pripravia sa štyri rôzne reakčné zmesi PCR, z ktorých každá obsahuje určité percento analógov dideoxynukleozid trifosfátu (ddNTP) k jednému zo štyroch nukleotidov (ATP, CTP, GTP alebo TTP).
Syntéza nového vlákna DNA pokračuje, kým sa nezačlení jeden z týchto analógov, kedy je vlákno predčasne skrátené. Každá PCR reakcia bude nakoniec obsahovať zmes rôznych dĺžok DNA reťazcov, všetky končiace nukleotidom, ktorý bol pre túto reakciu označený dideoxy. gél elektroforéza sa potom používa na oddelenie vlákien zo štyroch reakcií v štyroch samostatných dráhach a na určenie toho, aká je dĺžka reťazca s ktorým nukleotidom, končí dĺžka pôvodného templátu.
V automatizovanej Sangerovej reakcii sa používajú priméry, ktoré sú označené štyrmi rôznymi farebnými fluorescenčnými značkami. Reakcie PCR v prítomnosti rôznych dideoxynukleotidov sa uskutočňujú tak, ako je opísané vyššie. Ďalej sa však štyri reakčné zmesi spoja a aplikujú na jediný pruh gélu. Farba každého fragmentu sa deteguje pomocou laserového lúča a informácie sa zbierajú pomocou počítača ktorý generuje chromatogramy ukazujúce píky pre každú farbu, z ktorých môže byť templátová DNA sekvencia určené.
Typicky je automatizovaná sekvenčná metóda presná iba pre sekvencie do maximálnej dĺžky asi 700 - 800 párov báz. Je však možné získať úplné sekvencie väčších génov a v skutočnosti celých genómov pomocou postupných metód, ako je primer Walking a brokovnica.
V Primer Walking sa funkčná časť väčšieho génu sekvenuje pomocou Sangerovej metódy. Nové priméry sa generujú zo spoľahlivého segmentu sekvencie a používajú sa na pokračovanie v sekvenovaní tej časti génu, ktorá bola mimo rozsahu pôvodných reakcií.
Sekvencia brokovnice znamená náhodné rozdelenie požadovaného segmentu DNA na vhodnejšie (zvládnuteľné) fragmenty veľkosti, sekvencovanie každého fragmentu a usporiadanie kusov na základe prekrývania sekvencie. Táto technika bola uľahčená použitím počítačového softvéru na usporiadanie prekrývajúcich sa kusov.