Amplifikácia DNA prostredníctvom polymerázovej reťazovej reakcie

PCR znamenať polymerická reťazová reakcia, techniku ​​molekulárnej biológie na amplifikáciu segmentov DNA vytvorením viacerých kópií s použitím enzýmov DNA polymerázy za kontrolovaných podmienok. Len jedna kópia segmentu DNA alebo génu sa môže klonovať do miliónov kópií, čo umožňuje detekciu pomocou farbív a ďalších vizualizačných techník.

Proces PCR, ktorý bol vyvinutý v roku 1983, umožnil vykonávanie DNA sekvenovanie a identifikovať poradie nukleotidov v jednotlivých génoch. Metóda využíva tepelné cyklovanie alebo opakované zahrievanie a chladenie reakcie na roztavenie a replikáciu DNA. Ako PCR pokračuje, „nová“ DNA sa používa ako templát pre replikáciu a nasleduje reťazová reakcia, ktorá exponenciálne amplifikuje templát DNA.

Techniky PCR sa používajú v mnohých oblastiach biotechnológie vrátane proteínové inžinierstvo, klonovanie, forenzné vyšetrenie (DNA fingerprinting), testovanie otcovstva, diagnostika dedičných a / alebo infekčných chorôb a analýza vzoriek životného prostredia.

Najmä v prípade forenznej analýzy je PCR obzvlášť užitočná, pretože zosilňuje aj najmenšie množstvo dôkazov o DNA. PCR možno použiť aj na analýzu DNA, ktorá je stará tisíce rokov, a tieto techniky sa použili na identifikáciu všetkého od 800 000 rokov starého mamuta po múmie z celého sveta.

Tento krok je potrebný iba pre DNA polymerázy, ktoré vyžadujú PCR s rýchlym štartom. Reakcia sa zahreje na teplotu medzi 94 a 96 ° C a udržuje sa počas 1 až 9 minút.

Ak postup nevyžaduje inicializáciu, je prvým krokom denaturácia. Reakcia sa zahrieva na teplotu 94 až 98 ° C počas 20 až 30 sekúnd. Vodíkové väzby DNA templátu sú prerušené a vytvárajú sa jednovláknové molekuly DNA.

Reakčná teplota je nižšia ako 50 až 65 ° C a udržuje sa 20 až 40 sekúnd. Priméry nasedajú na jednovláknovú templát DNA. Teplota je počas tohto kroku mimoriadne dôležitá. Ak je príliš horúci, základný náter sa nemusí viazať. Ak je príliš chladno, základný náter sa môže nedokonale viazať. Dobrá väzba sa vytvorí, keď sa sekvencia primerov presne zhoduje so sekvenciou templátov.

Teplota v tomto kroku sa mení v závislosti od typu polymerázy. DNA polymeráza syntetizuje úplne nový reťazec DNA.

Tento krok sa uskutočňuje pri 70 až 74 ° C počas 5 až 15 minút po poslednom PCR cykle.

Tento krok je voliteľný. Teplota sa udržiava na 4 - 15 ° C a reakcia sa prikrýva.

Počas každého cyklu sa produkt (špecifická časť DNA, ktorá sa replikuje) zdvojnásobí.

Keď DNA polymeráza stráca aktivitu a spotrebováva činidlá, reakcia sa spomaľuje.

Už sa hromadia žiadne ďalšie produkty.