Tlmivý roztok TBE (Tris-borát-EDTA) je tlmivý roztok tvorený bázou Tris, kyselinou boritou a EDTA (kyselina etyléndiamíntetraoctová). Tento pufor sa často používa na elektroforézu na agarózovom géli pri analýze produktov DNA, ktoré sú výsledkom amplifikácie PCR, purifikačných protokolov DNA alebo klonovacích experimentov DNA.
Použitie TBE
Pufer TBE je zvlášť užitočný na separáciu menších fragmentov DNA (MW <1000), ako sú malé produkty reštrikčný enzým štiepenie. TBE má väčšiu vyrovnávaciu kapacitu a dá ostrejšie rozlíšenie ako vyrovnávacia pamäť TAE. Pufor TAE (Tris-acetát-EDTA) je roztok tvorený bázou Tris, kyselinou octovou a EDTA.
TBE je všeobecne drahší ako TAE a inhibuje DNA ligázu, čo môže spôsobiť problémy, ak sú zamýšľané následné kroky purifikácie a ligácie DNA. Pomocou troch jednoduchých krokov, ktoré nasledujú, sa dozviete, ako vytvoriť vyrovnávaciu pamäť TBE. Vytvorenie by nemalo trvať dlhšie ako 30 minút.
Čo potrebuješ
Na vytvorenie pufra TBE budete potrebovať iba štyri látky. Ostatné položky v tomto zozname sú zariadenia. Štyri požadované látky sú disodná soľ EDTA, báza Tris, kyselina boritá a deionizovaná voda.
Pokiaľ ide o vybavenie, budete potrebovať pH meter a kalibračné štandardy podľa potreby. Okrem toho budete chcieť asi 600 ml a 1 500 ml kadičky alebo banky. Zaokrúhlite svoje potreby na vybavenie sú odmerné valce, miešacie tyče a miešacie taniere.
Skôr ako začnete, skontrolujte inventár v laboratóriu, ktoré používate, aby ste sa uistili, že máte všetko, čo potrebujete. Nič nie je horšie ako zastaviť sa v polovici prípravy riešenia, pretože vám dôjdu správne materiály.
Ak je vaše laboratórium v škole alebo na pracovisku, overte si u príslušného personálu, či má všetky položky na sklade. Ak tak urobíte, môže to nakoniec ušetriť čas a energiu.
Hmotnosť formulácie je skrátená na FW. Je to atómová hmotnosť prvku vynásobená počtom atómov každého prvku vo vzorci, potom sa spočítajú všetky hmotnosti každého prvku dohromady.
Zásobné riešenie EDTA
Riešenie EDTA by sa malo pripraviť vopred. EDTA neprejde úplne do roztoku, kým sa pH neupraví na asi 8,0. Pre 500 ml zásobného roztoku 0,5 M EDTA navážte 93,05 g disodnej soli EDTA (FW = 372,2). Potom sa rozpustí v 400 ml deionizovanej vody a pH sa upraví pomocou NaOH (hydroxid sodný). Potom doplňte roztok na konečný objem 500 mililitrov.
Zásobné riešenie TBE
Pripravte koncentrovaný (5x) zásobný roztok TBE vážením 54 gramov bázy Tris (FW = 121,14) a 27,5. gramov kyseliny boritej (FW = 61,83) a rozpustením oboch v približne 900 mililitroch deionizovanej látky voda. Potom sa pridá 20 mililitrov 0,5 M (molárnosť alebo koncentrácia) EDTA (pH 8,0) a roztok sa upraví na konečný objem 1 liter. Tento roztok sa môže skladovať pri izbovej teplote, ale v starších roztokoch sa vytvorí zrazenina. Tlmivý roztok uchovávajte v sklenených fľašiach a ak sa vylúči zrazenina, zlikvidujte ju.
Pracovné riešenie TBE
Na elektroforézu na agarózovom géli sa môže použiť pufor TBE v koncentrácii 0,5 x (riedenie koncentrovaného zásobného roztoku 1:10). Zásobný roztok sa zriedi 10x deionizovanou vodou. Konečné koncentrácie rozpustenej látky sú 45 mM Tris-boritan a 1 mM (milimolárny) EDTA. Vyrovnávacia pamäť je teraz pripravená na použitie v systéme spustenie agarózového gélu.