Ako funguje polymerázová reťazová reakcia na zosilnenie génov

polymerázová reťazová reakcia (PCR) je molekulárna genetická technika na vytváranie viacerých kópií génu a je tiež súčasťou procesu sekvenovania génov.

Génové kópie sa vyrábajú pomocou vzorky DNA a táto technológia je dostatočne dobrá na vytvorenie viacerých kópií z jednej jedinej kópie génu nájdeného vo vzorke. PCR amplifikácia génu na vytvorenie miliónov kópií umožňuje detekciu a identifikáciu génových sekvencií pomocou vizuálnych techník založených na veľkosti a náboji (+ alebo -) časti DNA.

Za kontrolovaných podmienok sú malé segmenty DNA generované enzýmami známymi ako DNA polymerázy, ktoré pridávajú komplementárne deoxynukleotidy. (dNTPs) na kúsok DNA známy ako „šablóna“. Ešte menšie kúsky DNA, nazývané "priméry", sa používajú ako východiskový bod pre polymeráza.

Priméry sú malé umelo vytvorené kúsky DNA (oligoméry), zvyčajne dlhé 15 až 30 nukleotidov. Vyrábajú sa poznaním alebo hádaním krátkych sekvencií DNA na samotných koncoch amplifikovaného génu. Počas PCR sa sekvenovaná DNA zahrieva a dvojreťazce sa oddelia. Po ochladení sa priméry naviažu na šablónu (nazývané žíhanie) a vytvoria miesto, kde začne polymeráza.

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) bola umožnená objavom termofilných a termofilných polymerázové enzýmy (enzýmy, ktoré zachovávajú štrukturálnu integritu a funkčnosť po zahriatí na vysokú teploty). Kroky zahrnuté v technike PCR sú nasledovné:

• Vytvorí sa zmes s optimalizovanými koncentráciami templátu DNA, enzýmu polymerázy, primerov a dNTP. Schopnosť zahrievať zmes bez denaturácie enzýmu umožňuje denaturáciu dvojzávitnice vzorky DNA pri teplotách v rozmedzí 94 stupňov Celzia.
• Po denaturácii sa vzorka ochladí na miernejší rozsah, okolo 54 stupňov, čo uľahčuje aneláciu (naviazanie) primérov na templáty jednovláknovej DNA.
• V treťom kroku cyklu sa vzorka znovu zahreje na 72 stupňov, čo je ideálna teplota pre Taq DNA polymerázu, kvôli predĺženiu. Počas predlžovania využíva DNA polymeráza pôvodný jednovláknový reťazec DNA ako templát na pridanie komplementárnych dNTP na 3' konce každého priméru a generujú úsek dvojvláknovej DNA v oblasti požadovaného génu.
• Priméry, ktoré sa anelovali na sekvencie DNA, ktoré nie sú presnou zhodou, nezostávajú anelované pri 72 stupňoch, čím sa obmedzuje predĺženie na požadovaný gén.

Tento proces denaturácie, žíhania a predlžovania sa opakuje viackrát (30-40) krát, čím sa exponenciálne zvyšuje počet kópií požadovaného génu v zmesi. Hoci tento proces by bol dosť únavný, ak by sa vykonával ručne, vzorky je možné pripraviť a inkubovať v a programovateľný termocykler, ktorý je v súčasnosti bežný vo väčšine molekulárnych laboratórií, a možno v ňom vykonať kompletnú reakciu PCR 3-4 hodiny.

Každý denaturačný krok zastaví proces predlžovania predchádzajúceho cyklu, čím sa skráti nový reťazec DNA a zachová sa približne na veľkosť požadovaného génu. Trvanie elongačného cyklu sa môže predĺžiť alebo skrátiť v závislosti od veľkosti požadovaného génu, ale prípadne prostredníctvom opakovaných cyklov PCR, väčšina templátov bude obmedzená na veľkosť samotného génu záujmu, pretože budú vytvorené z produktov oboch primery.

Existuje niekoľko rôznych faktory úspešnej PCR ktoré možno manipulovať s cieľom zlepšiť výsledky. Najpoužívanejšou metódou na testovanie prítomnosti produktu PCR je elektroforéza na agarózovom géli. Ktorý sa používa na oddelenie fragmentov DNA na základe veľkosti a náboja. Fragmenty sa potom vizualizujú pomocou farbív alebo rádioizotopov.

Od objavu PCR boli objavené DNA polymerázy iné ako pôvodný Taq. Niektoré z nich majú lepšiu schopnosť „korektúry“ alebo sú stabilnejšie pri vyšších teplotách, čím sa zlepšuje špecifickosť PCR a znižuje sa počet chýb spôsobených vložením nesprávneho dNTP.

Niektoré variácie PCR boli navrhnuté pre špecifické aplikácie a teraz sa pravidelne používajú v molekulárno-genetických laboratóriách. Niektoré z nich sú PCR v reálnom čase a PCR s reverznou transkriptázou. Objav PCR tiež viedol k vývoju sekvenovania DNA, DNA odtlačky prstov a iné molekulárne techniky.