Restrikčné endonukleázy sú triedou enzým ktoré štiepia molekuly DNA. Každý enzým rozpoznáva jedinečné sekvencie nukleotidov v reťazci DNA - obvykle asi štyri až šesť párov báz. Sekvencie sú palindromické v tom, že komplementárne vlákno DNA má rovnakú sekvenciu v opačnom smere. Inými slovami, oba reťazce DNA sú narezané na rovnakom mieste.
Kde sa tieto enzýmy nachádzajú
Restrikčné enzýmy sa nachádzajú v mnohých rôznych kmeňoch baktérií, kde ich biologickou úlohou je podieľať sa na obrane buniek. Tieto enzýmy obmedzujú cudziu (vírusovú) DNA, ktorá vstupuje do buniek ich ničením. Hostiteľské bunky majú systém modifikácie reštrikcie, ktorý metyluje svoju vlastnú DNA v miestach špecifických pre ich príslušné reštrikčné enzýmy, čím ich chráni pred štiepením. Viac ako 800 známe enzýmy Zistilo sa, že rozpoznávajú viac ako 100 rôznych nukleotidových sekvencií.
Typy reštrikčných enzýmov
Existuje päť rôznych typov reštrikčných enzýmov. Typ I štiepi DNA v náhodných miestach až do 1 000 alebo viacerých párov báz od rozpoznávacieho miesta. Typ III odreže približne 25 párov báz od miesta. Oba tieto typy vyžadujú ATP a môžu to byť veľké enzýmy s viacerými podjednotkami. Enzýmy typu II, ktoré sa prevažne používajú v biotechnológii, rozrezávajú DNA v rozpoznávanej sekvencii bez potreby ATP a sú menšie a jednoduchšie.
Reštrikčné enzýmy typu II sú pomenované podľa druhu baktérií, z ktorého sú izolované. Napríklad enzým EcoRI bol izolovaný z E. coli. Väčšina verejnosti pozná E. ohniská E. coli v potravinách.
Reštrikčné enzýmy typu II môžu generovať dva rôzne typy rezov v závislosti od toho, či rezajú oboje vlákna v strede rozpoznávacej sekvencie alebo každého vlákna bližšie k jednému koncu rozpoznávania sekvencie.
Bývalý rez vytvorí "tupé konce" bez nukleotidových presahov. Ten generuje "lepkavé" alebo "kohézne" konce, pretože každý výsledný fragment DNA má previs, ktorý dopĺňa ostatné fragmenty. Obidve látky sú užitočné pri výrobe molekulárnej genetiky rekombinantná DNA a proteíny. Táto forma DNA vyniká, pretože je produkovaná ligáciou (spájaním) dvoch alebo viacerých rôznych vlákien, ktoré neboli pôvodne spojené.
Enzýmy typu IV rozpoznávajú metylovanú DNA a enzýmy typu V používajú RNA na rezanie sekvencií na napadajúcich organizmoch, ktoré nie sú palindromické.
Použitie v biotechnológii
Restrikčné enzýmy sa používajú v biotechnológii na rozštiepenie DNA na menšie vlákna, aby sa študovali rozdiely v dĺžke fragmentov medzi jednotlivcami. Toto sa označuje ako polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov (RFLP). Používajú sa tiež na klonovanie génov.
Techniky RFLP sa použili na stanovenie, že jednotlivci alebo skupiny jednotlivcov majú výrazné rozdiely v sekvenciách génov a reštrikčných štiepnych vzorcoch v určitých oblastiach genómu. Znalosť týchto jedinečných oblastí je základom Odtlačky DNA. Každá z týchto metód závisí od použitia elektroforéza na agarózovom géli na separáciu fragmentov DNA. Pufer TBE, ktorý je tvorený bázou Tris, kyselinou boritou a EDTA, sa bežne používa pre agarózový gél. elektroforéza skúmať produkty DNA.
Použitie v klonovaní
Klonovanie často vyžaduje vloženie génu do plazmidu, ktorý je typom časti DNA. Enzýmy s obmedzením môžu pri tomto procese pomôcť, pretože jednovláknové previsy, ktoré zanechávajú pri rezaní. DNA ligáza, samostatný enzým, môže spojiť dve molekuly DNA so zodpovedajúcimi koncami.
Použitím reštrikčných enzýmov s enzýmami DNA ligázy sa teda môžu časti DNA z rôznych zdrojov použiť na vytvorenie jednej molekuly DNA.