Pufer TAE je roztok tvorený bázou Tris, kyselinou octovou a EDTA (Tris-acetát-EDTA). Je to historicky najbežnejší pufor používaný pre agarózový gél elektroforéza v analýzach produktov DNA vznikajúcich z PCR zosilnenie, DNA purifikačné protokoly alebo Klonovanie DNA experimenty.
Tento tlmivý roztok má nízku iónovú silu a nízku tlmivú kapacitu. Je najvhodnejší pre elektroforézu veľkých (> 20 kilobáz) kúskov DNA a bude potrebné ho často vymieňať alebo recirkulovať na dlhšie (> 4 hodiny) doby gélu. S ohľadom na to môžete zvážiť vytvorenie niekoľkých šarží pufra.
Vzhľadom na to, že tlmivý roztok sa dá ľahko vyrobiť a kroky sa môžu vykonať rýchlo, nie je časovo náročné ani zložité robiť viac ako jednu dávku naraz. Vytvorenie pufra TAE by malo trvať iba 30 minút podľa pokynov uvedených nižšie.
Čo potrebujete pre vyrovnávaciu pamäť TAE
Pretože vytvorenie vyrovnávacej pamäte TAE vyžaduje iba rýchlu a jednoduchú sadu pokynov, počet materiálov potrebných na jej vykonanie nie je nadmerný. Potrebujete iba disodnú soľ EDTA (kyselina etyléndiamíntetraoctová), bázu Tris a ľadovú kyselinu octovú.
Výroba tlmivého roztoku tiež vyžaduje pH meter a kalibračné štandardy, podľa potreby. Budete tiež potrebovať kadičky alebo banky s objemom 600 mililitrov a 1500 mililitrov, ako aj odmerné valce. Nakoniec budete potrebovať deionizovanú vodu, miešadlá a miešacie taniere.
V nasledujúcich pokynoch sa hmotnosť vzorca (atómová hmotnosť každého prvku vynásobí počtom atómov, potom sa hmotnosť každého z nich pridá spolu) sa označuje ako FW.
Pripravte zásobný roztok EDTA
Riešenie EDTA sa pripravuje vopred. EDTA neprejde úplne do roztoku, kým sa pH neupraví na asi 8,0. Pre zásobu 500 mililitrov roztok 0,5 M (molárnosť alebo koncentrácia) EDTA, odvážte 93,05 g disodnej soli EDTA (FW = 372,2). Rozpustite ju v 400 mililitroch deionizovanej vody a upravte pH hydroxidom sodným (NaOH). Doplní sa roztok na konečný objem 500 mililitrov.
Vytvorte svoje zásobné riešenie
Pripravte koncentrovaný (50x) zásobný roztok TAE navážením 242 gramov bázy Tris (FW = 121,14) a rozpustením v približne 750 mililitroch deionizovanej vody. Opatrne sa pridá 57,1 mililitrov ľadovej kyseliny a 100 mililitrov 0,5 M EDTA (pH 8,0).
Potom sa roztok upraví na konečný objem 1 liter. Tento zásobný roztok sa môže skladovať pri izbovej teplote. PH tohto tlmivého roztoku nie je upravené a malo by byť asi 8,5.
Pripravte pracovné riešenie pufra TAE
Pracovný roztok 1x TAE tlmivého roztoku sa pripraví jednoduchým zriedením zásobného roztoku 50x deionizovanou vodou. Konečné koncentrácie rozpustenej látky sú 40 mM (milimolárny) Tris-acetát a 1 mM EDTA. Pufr je teraz pripravený na použitie pri agarózovom géli.
Zabalenie
Skôr ako začnete, skontrolujte inventár a uistite sa, že máte všetky vyššie uvedené materiály pre tlmivý roztok TAE. Pracovníci zásobovania by vám mali vedieť povedať, či majú na sklade všetky potrebné položky. Nechcete nakoniec skončiť niečo, čo uprostred postupu.