Postup Gramovho farbenia v mikrobiológii

Gramovo farbenie je diferenciálna metóda farbenia použitá na priradenie baktérie do jednej z dvoch skupín (grampozitívna a gramnegatívna) na základe vlastností ich bunkové steny. Je tiež známa ako Gramovo farbenie alebo Gramova metóda. Procedúra je pomenovaná pre osobu, ktorá vyvinula túto techniku, dánskeho bakteriológa Hansa Christiana Grama.

Postup je založený na reakcii medzi peptidoglykánom v bunkových stenách niektorých baktérií. Gramovo farbenie zahrnuje farbenie baktérií, fixáciu farby moridlom, odfarbenie buniek a aplikáciu kontrastného farbiva.

1. Primárne škvrny (kryštalická fialová) sa viaže na peptidoglykán, sfarbenie buniek fialové. Grampozitívne aj gramnegatívne bunky majú vo svojich bunkových stenách peptidoglykán, takže spočiatku sa všetky baktérie zafarbia fialovo.
2. Gramov jód (jód a jodid draselný) sa používa ako moridlo alebo fixačné činidlo. Gram-pozitívne bunky tvoria kryštalický fialový-jódový komplex.
3. alkohol alebo acetón sa používa na odfarbenie buniek. Gramnegatívne baktérie majú v bunkových stenách oveľa menej peptidoglykánov, takže tento krok ich v podstate robí bezfarebnými, zatiaľ čo z grampozitívnych buniek, ktoré majú viac peptidoglykánu (60 - 90% bunkovej steny), sa odstráni iba časť farby. Hustá bunková stena grampozitívnych buniek sa dehydratuje odfarbovacím krokom, čo spôsobuje, že sa zmršťujú a zachytávajú komplex farbivo-jód vo vnútri.
   instagram viewer
4. Po kroku odfarbenia sa aplikuje kontrastný prostriedok (zvyčajne safranín, ale niekedy fuchsín) na zafarbenie baktérií na ružovú. Grampozitívne aj gramnegatívne baktérie zachytávajú ružové sfarbenie, nie je však vidieť cez tmavšiu fialovú grampozitívnu baktériu. Ak sa postup farbenia vykonáva správne, grampozitívne baktérie budú fialové, zatiaľ čo gramnegatívne baktérie budú ružové.

Výsledky Gramovho farbenia sú zobrazené pomocou svetelnej mikroskopie. Pretože sú baktérie zafarbené, nie je identifikovaná iba ich Gramova škvrna, ale ich tvar, je možné pozorovať veľkosť a zhlukovanie. Vďaka tomu je Gram farbenie cenným diagnostickým nástrojom pre lekársku kliniku alebo laboratórium. Aj keď škvrna nemusí definitívne identifikovať baktérie, na predpísanie účinného antibiotika postačuje často vedieť, či sú gram-pozitívne alebo gram-negatívne.

Niektoré baktérie môžu byť gram-variabilné alebo gram-neurčité. Avšak aj tieto informácie môžu byť užitočné pri znižovaní bakteriálnej identity. Táto technika je najspoľahlivejšia, ak sú kultúry staršie ako 24 hodín. Aj keď sa dá použiť na kultúry vývaru, je najlepšie ich najskôr odstrediť. Primárne obmedzenie tejto techniky je v tom, že vedie k nesprávnym výsledkom, ak sa v technike urobia chyby. Na dosiahnutie spoľahlivého výsledku sú potrebné postupy a zručnosti. Infekčné činidlo tiež nemusí byť bakteriálne. Eukaryotické patogény farbia gramnegatívne. Avšak najviac eukaryotické bunky s výnimkou húb (vrátane kvasiniek), ktoré sa počas procesu nelepia na podložné sklíčko.

• Kryštálová fialová (primárne morenie)
• Gramov jód (moridlo na fixovanie kryštálovej fialovej v bunkovej stene)
• Etanol alebo acetón (odfarbovač)
• Safranin (sekundárne farbenie alebo kontrastné farbenie)
• Voda v striekacej fľaši alebo kvapkacej fľaši
• Mikroskopické sklíčka
• Zložený mikroskop

1. Položte malú kvapku bakteriálnej vzorky na podložné sklíčko. Baktérie tepelne fixujte na podložné sklíčko tak, že ich trikrát prejdete plameňom Bunsenovho horáka. Príliš veľa tepla alebo príliš dlho môže roztaviť bunkové steny baktérií, narušiť ich tvar a viesť k nepresnému výsledku. Ak sa aplikuje príliš málo tepla, baktérie počas farbenia vymývajú podložné sklíčko.
2. Pomocou kvapkadla naneste na sklíčko primárne zafarbenie (kryštálovú fialovú) a nechajte ho sedieť 1 minútu. Opatrne opláchnite podložku vodou nie dlhšie ako 5 sekúnd, aby ste odstránili nadbytočné škvrny. Príliš dlhé oplachovanie môže odstrániť príliš veľa farby, zatiaľ čo nedostatočné oplachovanie môže spôsobiť, že príliš veľa škvŕn zostane na gramnegatívnych bunkách.
3. Pomocou kvapkadla naneste na sklíčko Gramov jód, aby ste kryštalickú fialovú fixovali na bunkovej stene. Nechajte ho sedieť 1 minútu.
4. Opláchnite podložné sklíčko alkoholom alebo acetónom asi 3 sekundy, potom ich okamžite okamžite opláchnite vodou. Gram-negatívne bunky stratia farbu, zatiaľ čo gram-pozitívne bunky zostanú fialové alebo modré. Ak však odfarbovač zostane príliš dlho, všetky bunky stratia farbu!
5. Naneste sekundárne škvrny, safranín a nechajte ich 1 minútu sedieť. Opatrne opláchnite vodou nie dlhšie ako 5 sekúnd. Gramnegatívne bunky by mali byť zafarbené červeno alebo ružovo, zatiaľ čo grampozitívne bunky sa budú stále javiť fialové alebo modré.
6. Prejdite podložné sklíčko pomocou zloženého mikroskopu. Na rozlíšenie tvaru a usporiadania bunky môže byť potrebné zväčšenie 500x až 1000x.

Nie všetky baktérie identifikované Gramovým farbením sú spojené s chorobami, ale niekoľko dôležitých príkladov zahŕňa:

• Grampozitívne koky (okrúhle):Staphylococcus aureus
• Gramnegatívne koky:Neisseria meningitidis
• Grampozitívne bacily (tyčinky): Bacillus anthracis
• Gramnegatívne bacily:Escherichia coli